Warum ist es notwendig, vor der Durchflusszytometrie von Hefezellen einen Ultraschall-Zellaufbrecher zu verwenden? Sicherstellung der Datenrichtigkeit

Die Hauptfunktion eines Ultraschall-Zellaufbrechers oder Homogenisators in diesem Zusammenhang ist die mechanische Trennung von aggregierten Hefezellen. Die Durchflusszytometrie basiert auf der Analyse von Partikeln in einer einzelnen Reihe; daher muss die Probe zu einer gleichmäßigen Einzelzellsuspension verarbeitet werden, um Datenverfälschungen durch Zellaggregation zu verhindern.

Das Gerät nutzt hochfrequente Schallwellen, um Kavitation zu erzeugen, die Zellaggregate deagglomeriert. Dies stellt sicher, dass das Durchflusszytometer einzelne Zellen und keine Klumpen erkennt, wodurch Zählfehler vermieden und eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals gewährleistet wird.

Der Mechanismus: Von Klumpen zu Einzelzellen

Erzeugung von Kavitation

Ultraschallhomogenisatoren funktionieren, indem sie hochfrequente Schallwellen in die flüssige Probe übertragen. Diese Wellen erzeugen abwechselnde Hochdruck- und Niederdruckzyklen.

Die Kraft von Mikroblasen

Während des Niederdruckzyklus bilden sich mikroskopische Vakuumblasen in der Flüssigkeit. Wenn diese Blasen während des Hochdruckzyklus kollabieren, wird dieses Phänomen als Kavitation bezeichnet.

Mechanische Deagglomeration

Der Kollaps dieser Blasen erzeugt intensive, lokalisierte Druck- und Scherkräfte. Wie in Anwendungen der Materialwissenschaften festgestellt, ist diese Kraft stark genug, um agglomerierte Strukturen effektiv zu dispergieren. In biologischen Kontexten bricht diese physikalische Kraft die Bindungen, die Hefezellen zusammenhalten, ohne die Zellen selbst notwendigerweise zu zerstören.

Warum die Durchflusszytometrie Homogenität erfordert

Verhinderung von Koinzidenzereignissen

Durchflusszytometer sind Flüssigkeitssysteme, die so konzipiert sind, dass Zellen einzeln durch einen Laserstrahl laufen. Wenn Hefezellen als Cluster (Agglomerat) in den Strom gelangen, kann die Maschine sie als ein einziges, großes Ereignis registrieren und nicht als mehrere einzelne Ereignisse.

Sicherstellung einer genauen Signalquantifizierung

Wenn Zellen zusammenkleben, vermischen sich ihre Fluoreszenzsignale. Dies führt zu Erfassungsfehlern, bei denen ein Cluster aus negativen und positiven Zellen falsch interpretiert werden könnte oder die Intensität eines Signals künstlich erhöht wird.

Gleichmäßige Exposition

So wie die Ultraschallbehandlung Nanomaterialien für chemische Reaktionen vollständig freilegt, stellt sie sicher, dass Hefezellen vollständig suspendiert sind. Dies ermöglicht es der Scheidenflüssigkeit im Zytometer, die Zellen für den Laserinterrogationspunkt richtig auszurichten.

Verständnis der Kompromisse

Das Risiko der Zelllyse

Obwohl das Ziel die Deagglomeration ist, handelt es sich bei dem Gerät technisch gesehen um einen "Zellaufbrecher". Wenn die Amplitude zu hoch oder die Einwirkzeit zu lang ist, gehen die Kavitationskräfte von der Trennung von Zellen zur Aufbrechung von Membranen (Lyse) über. Dies würde die für die Analyse vorgesehene Probe zerstören.

Wärmeerzeugung

Die Energieübertragung während der Kavitation erzeugt erhebliche Wärme. Wenn die Probe nicht auf Eis gehalten oder in kurzen Stößen (Pulsieren) verarbeitet wird, kann die steigende Temperatur die Hefezellen schädigen oder hitzeempfindliche Fluorophore abbauen, was den Assay beeinträchtigt.

Die richtige Wahl für Ihr Ziel treffen

Um zuverlässige Durchflusszytometriedaten zu erhalten, müssen Sie eine ausreichende Agitation mit der Probenkonservierung in Einklang bringen.

• Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf genauen Zellzählungen liegt: Priorisieren Sie die Überprüfung der Einzelzellsuspension unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Ultraschalldauer ausreichte, um alle Doppelzellen aufzubrechen.
• Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf Zellviabilität oder Physiologie liegt: Verwenden Sie kurze Ultraschallpulse und halten Sie die Probe gekühlt, um Hitzeschäden oder Membranbrüche während der Deagglomeration zu verhindern.

Eine ordnungsgemäße Ultraschallvorbereitung verwandelt eine verrauschte, unzuverlässige Hefeprobe in einen Datensatz, dem Sie vertrauen können.

Zusammenfassungstabelle:

Faktor	Auswirkung auf die Durchflusszytometrie	Ultraschalllösung
Zellaggregation	Verursacht Zählfehler und Signalrauschen	Mechanische Deagglomeration durch Kavitation
Signalgenauigkeit	Überschätzte Fluoreszenz von Clustern	Gewährleistet gleichmäßige Einzelzellsuspension
Probenzustand	Verstopfung des Flüssigkeitssystems und Datenverfälschung	Hochfrequente Scherkräfte brechen Zellbindungen
Risikokontrolle	Übermäßige Hitze oder Lyse können Proben beschädigen	Optimierte Amplitude und gepulste Sonikation

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Referenzen

1. Afonso Fontes, Teresa Lopes da Silva. Monitoring Yeast Cultures Grown on Corn Stover Hydrolysate for Lipid Production. DOI: 10.3390/pr12030558

Dieser Artikel basiert auch auf technischen Informationen von Kintek Solution Wissensdatenbank .